IDT Alt-R™ CRISPR-Cas12a(Cpf1)基因編輯系統(tǒng)工具
——crRNA化學(xué)定制合成，重組Cas12a核酸酶
北京澤平代理的進(jìn)口IDT（Integrated DNA Technologies）Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）基因編輯系統(tǒng)，提供CRISPR-Cas12a（Cpf1）中crRNA（CRISPR-derived RNA）的化學(xué)合成定制服務(wù)，并生產(chǎn)商品化通用型重組Cas12a核酸酶（Cas12a nuclease，即Cpf1核酸酶，限制性內(nèi)切酶，基因組DNA雙鏈剪切）、以及增強(qiáng)RNP（ribonucleoprotein，核糖核蛋白復(fù)合體）電轉(zhuǎn)染效率的電穿孔增強(qiáng)劑、增強(qiáng)HDR（Homology directed repair，同源重組修復(fù)）概率的HDR增強(qiáng)劑、HDR供體DNA的化學(xué)合成服務(wù)，提供多重基因組編輯所需全套試劑的工具平臺(tái)，為因物種基因組富含A、T、DNA靶點(diǎn)不合適而無法使用常規(guī)IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9系統(tǒng)，提供了更多選擇。
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▲IDT Alt-R CRISPR-Cas12a（Cpf1）系統(tǒng)（crRNA、Cas12（Cpf1）核酸酶、電穿孔增強(qiáng)劑、HDR增強(qiáng)劑、HDR DNA供體）
▲IDT Alt-R CRISPR-Cas9系統(tǒng)
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IDT Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）概述
IDT的Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）系統(tǒng)，對crRNA序列進(jìn)行優(yōu)化縮短、化學(xué)修飾，對Cas12a（Cpf1）核酸酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行優(yōu)化，獲得了高保真的雙鏈剪切功能，使用時(shí)僅需混合crRNA和Cas12a（Cpf1）核酸酶，再通過電穿孔（如Lonza Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)）轉(zhuǎn)染RNP，可進(jìn)行精確地基因編輯操作。
傳統(tǒng)構(gòu)建CRISPR-Cas12a（Cpf1）質(zhì)粒的方法，質(zhì)粒大小高達(dá)6-10kb，很難轉(zhuǎn)染，而如使用原代細(xì)胞等難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率更低。且質(zhì)粒不斷產(chǎn)生CRISPR-Cas12a，使脫靶率顯著增加。IDT轉(zhuǎn)染RNP蛋白復(fù)合體的方法，通過優(yōu)化CRISPR-Cas12a（Cpf1）組件，在提升剪切精確性的基礎(chǔ)上，提高轉(zhuǎn)染效率、減少細(xì)胞毒性、降低脫靶率，進(jìn)而提高了基因編輯效率。
IDT Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）產(chǎn)品
1、Cas12a（Cpf1）核酸酶
Alt-R™ Cas12a（Cpf1）核酸酶，添加核定位序列（Nuclear localization sequence，NLS），經(jīng)序列優(yōu)化，提高中靶率，降低脫靶率。V3酶和Ultra酶均可識(shí)別TTTV，而Ultra核酸酶增加了對TTTT的PAM（前間區(qū)序列鄰近基序，protospacer adjacent motif）識(shí)別。注：V=A、C、G
| 貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
| 1081068 |
Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) V3, 100 µg |
100 µg |
識(shí)別TTTV位點(diǎn)，10 µg/µL，100 µg = 633 pmol |
| 1081069 |
Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) V3, 500 µg |
500 µg |
| 10001272 |
Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra, 100 µg |
100 µg |
識(shí)別TTTN位點(diǎn)，N表示A、T、C、G堿基 |
| 10001273 |
Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra, 500 µg |
500 µg |
| 10007804 |
Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra, 5 mg |
5 mg |
| 10007922 |
Alt-R™ L.b. Cas12a (Cpf1) Ultra, 100 µg |
100 µg |
識(shí)別TTTN位點(diǎn)，10 µg/µL，100 µg = 670 pmol |
| 10007923 |
Alt-R™ L.b. Cas12a (Cpf1) Ultra, 500 µg |
500 µg |
| 10007924 |
Alt-R™ L.b. Cas12a (Cpf1) Ultra, 5 mg |
5 mg |
2、crRNA（定制）
Alt-R™ Cas12a crRNA，定制合成的crRNA，包含20-24nt的特異性序列（定制）和20nt的通用序列，相比野生型，序列更短，中靶率更高。經(jīng)化學(xué)修飾防止被細(xì)胞核糖核酸酶降解。需要與Cas12a（Cpf1）核酸酶結(jié)合形成RNP復(fù)合體。
| 貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
| 定制 |
Alt-R™As Cas12a crRNA，2 nmol |
2 nmol |
40-45bp，與As.cas12a酶結(jié)合使用 |
| 定制 |
Alt-R™As Cas12a crRNA，10 nmol |
10 nmol |
| 定制 |
Alt-R™ L.b. Cas12a crRNA, 2 nmol |
2 nmol |
40-45bp，與L.b.cas12a酶結(jié)合使用 |
| 定制 |
Alt-R™ L.b. Cas12a crRNA, 10 nmol |
10 nmol |
3、電穿孔增強(qiáng)劑
Alt-R™ Cas12a電穿孔Enhancer，是Cas12a特異性的載體DNA，當(dāng)使用原代細(xì)胞或難轉(zhuǎn)染細(xì)胞系時(shí)，可提高Lonza(原Amaxa）Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)等電穿孔設(shè)備的對RNP的轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)而提高實(shí)驗(yàn)效率。
| 貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
| 1076300 |
Alt-R™ Cpf1 Electroporation Enhancer, 2 nmol |
2 nmol |
電穿孔增強(qiáng)劑，增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率 |
| 1076301 |
Alt-R™ Cpf1 Electroporation Enhancer, 10 nmol |
10 nmol |
4、HDR增強(qiáng)劑
Alt-R™ HDR Enhancer，小分子化合物，可提高同源重組修復(fù)概率。在包括貼壁、懸浮的大量細(xì)胞系中均有活性，可用于Cas12a（Cpf1）核酸酶、Cas9核酸酶。
| 貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
| 10007910 |
Alt-R™ HDR Enhancer V2, 30 µL |
30 µL |
HDR增強(qiáng)劑，增加同源重組修復(fù)傾向性 |
| 10007921 |
Alt-R™ HDR Enhancer V2, 150 µL |
150 µL |
| 1081072 |
Alt-R™ HDR Enhancer, 100 µL |
100 µL |
| 1081073 |
Alt-R™ HDR Enhancer, 500 µL |
500 µL |
5、供體DNA（定制）
Alt-R™ HDR供體寡核苷酸：專門為同源重組修復(fù)基因敲入開發(fā)，具有比標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸更高的穩(wěn)定性和更高的摻入率。
| 貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
| 定制 |
Alt-R HDR Donor Oligo, 2 nmol |
2 nmol |
45-200nt，Alt-R修飾和硫代磷酸酯PS修飾 |
| 定制 |
Alt-R HDR Donor Oligo, 10 nmol |
10 nmol |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 201-500 bp, 3 µg |
3 µg |
非常適合進(jìn)行段基因組的修改和插入；帶修飾雙鏈DNA |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 201-500 bp, 10 µg |
10 µg |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 501-2000 bp, 3 µg |
3 µg |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 501-2000 bp, 10 µg |
10 µg |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 2001-3000 bp, 3 µg |
3 µg |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 2001-3000 bp, 10 µg |
10 µg |
IDT Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）實(shí)驗(yàn)流程
1、設(shè)計(jì)crRNA，使其間隔區(qū)（Spacer）序列與DNA靶序列互補(bǔ)，提交給IDT定制合成crRNA；
2、將crRNA與Cas12a（Cpf1）核酸酶混勻，形成核糖核蛋白體（ribonucleoprotein，簡稱RNP)；
3、將RNP通過電轉(zhuǎn)染等導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞核；
4、通過crRNA的Spacer識(shí)別DNA靶序列，通過Cas12a蛋白識(shí)別PAM序列，對DNA進(jìn)行剪切；
5、對DNA斷裂處進(jìn)行修復(fù)
①進(jìn)行非同源末端連接修復(fù)(Non-homologous end-joining，簡稱NHEJ），實(shí)現(xiàn)基因敲除（knockout）；
②（使用IDT序列設(shè)計(jì)工具）設(shè)計(jì)供體DNA模板，進(jìn)行同源重組修復(fù)（Homology directed repair，簡稱HDR），實(shí)現(xiàn)基因敲入（knockoin）、基因敲除、基因沉默等。
IDT Alt-R™ crRNA序列設(shè)計(jì)示意圖
Cas12a系統(tǒng)和Cas9系統(tǒng)區(qū)別和應(yīng)用
| IDT Alt-R™ CRISPR |
Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）系統(tǒng) |
Alt-R™ CRISPR-Cas9系統(tǒng) |
| Alt-R™ Cas12a V3核酸酶 |
Alt-R™ Cas12a Ultra核酸酶 |
Alt-R™ Cas9核酸酶 |
Alt-R™ Cas9切口酶 |
| 特點(diǎn) |
通用Cas12a酶，富含AT的物種，或使用CRISPR-Cas9有限制 |
經(jīng)序列優(yōu)化的Cas12a酶，比Cas12a通用型性能更佳 |
通用Cas9酶，易于使用且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠 |
突變的Cas9酶，保留單鏈切割能力 |
| PAM識(shí)別 |
TTTV |
TTTN |
NGG |
| DNA切割 |
雙鏈 |
雙鏈 |
單鏈 |
| 末端 |
5’突出 |
平末端 |
5’突出/3‘突出 |
| 建議用途 |
無法使用Cas9的實(shí)驗(yàn) |
需要高基因編輯效率的實(shí)驗(yàn) |
一般實(shí)驗(yàn) |
適用于同時(shí)使用2種crRNA，各自識(shí)別并切割2條鏈中一條，通過將spacer由20nt提高到40nt，實(shí)現(xiàn)更高特異性 |
| 規(guī)格 |
100 μg或500 μg |
| Cas12a+crRNA |
crRNA |
20-24nt特異性序列（推薦使用21nt），20nt通用序列 |
\ |
| Cas9+gRNA |
crRNA |
\ |
19-20nt特異性序列（推薦使用20nt），16nt通用序列 |
| tracrRNA |
\ |
67nt通用序列 |
| Cas9+sgRNA |
sgRNA |
\ |
19-20nt特異性序列（推薦使用20nt），80nt通用序列，經(jīng)過序列修飾，不會(huì)引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，不會(huì)激活無關(guān)的基因 |
注：
N=任意堿基
V=A、C、G
參考文獻(xiàn)
1.Conformational Activation Promotes CRISPR-Cas12a Catalysis and Resetting of the Endonuclease Activity. Stefano Stella,et al., Cell, Volume 175, Issue 7, 13 December 2018, Pages 1856-1871.e21
2. Switching the activity of Cas12a using guide RNA strand displacement circuits
. Lukas Oesinghaus & Friedrich C. Simmel, Nature Communications volume 10, Article number: 2092 (2019)
3. Sequence-Specific Recognition of HIV-1 DNA with Solid-State CRISPR-Cas12a-Assisted Nanopores (SCAN). Reza Nouri,et al., ACS Sens. 2020, 5, 5, 1273–1280
4. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Xiong Ding,et al., Nature Communications volume 11, Article number: 4711 (2020)
5. Broad-spectrum enzymatic inhibition of CRISPR-Cas12a. Gavin J. Knott,et al., Nature Structural & Molecular Biology volume 26, pages315–321(2019)
6. Structural Basis for the Inhibition of CRISPR-Cas12a by Anti-CRISPR Proteins. HengZhang,et al.,Cell Host & Microbe, Volume 25, Issue 6, 12 June 2019, Pages 815-826.e4
7. Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a. Isabel Strohkendl,et al., Molecular Cell,Volume 71, Issue 5, 6 September 2018, Pages 816-824.e3
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